肝脏是药物暴露的主要器官，在药物的代谢和毒性反应中担任着关键角色。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）保留了完整的细胞特性以及生理水平的酶和辅助因子，包括细胞膜上的酶如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶，以及胞质酯酶，因此覆盖了肝脏中的所有代谢途径。因此，原代肝细胞被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，并且在药物相互作用、药物代谢和毒性研究中备受研究者青睐。本文将总结原代肝细胞基于二维（2D）和三维（3D）培养模型在药物研发中的应用。

一、原代肝细胞的分离方法

原代肝细胞的分离通常采用两步胶原酶灌注法。较小动物通过门静脉或下腔静脉进行肝脏灌注，而较大动物则经由肝叶或肝段进行灌注。成功分离肝细胞需要几个关键因素，包括无细胞毒性的胶原酶、适当的消化时机以及良好的肝脏状况。为确保肝细胞的高活性和产量，肝脏应迅速冷却以减缓代谢速率，防止缺氧和缺血。分离的原代肝细胞在药物研究中应满足以下标准：1、实验开始时活率80%，在整个实验期间活率下降<20%；2、对2-3种已知上市药物的代谢进行检测，结果应符合文献值；3、典型诱导剂如利福平应使CYP3A4等特定酶的活性增加至少三倍；4、冻存肝细胞在接种4-6小时后应达到70%的贴壁率。

二、原代肝细胞的2D培养

悬浮肝细胞模型能够提供完整的药物代谢酶和辅助因子，适合用于研究不同的代谢清除途径。然而，随着体外孵育时间增加，悬浮肝细胞的活性和代谢酶活性会逐渐降低，最大孵育时间通常限制在4小时，主要用于估计中高清除速率药物的清除。当清除率低于20%时，难以准确判断其清除值。为解决慢代谢化合物的检测挑战，可采用悬浮肝细胞接力方法，以延长孵育时间至20小时或更长。

贴壁肝细胞模型采用原代肝细胞在胶原蛋白包被的培养表面进行2D培养。尽管肝细胞在此形式中能够呈现上皮形态，仍存有一些缺陷，包括细胞极性和功能的改变，缺乏正常功能所需的其它相关细胞类型，以及无法提供充足的营养和旁分泌因子以支持肝细胞的正常功能。

应用实例

• 药物-药物相互作用研究：如酶诱导、抑制和转运体研究。
• 肝毒性评估：通过观察细胞形态变化、坏死和凋亡等。
• 慢代谢化合物清除率及其代谢产物的评估：基于贴壁肝细胞的接力法研究。
• 小核酸药物的靶向肝细胞摄取和沉默效果评估。

三、原代肝细胞的3D培养

球状体模型采用超低粘附培养技术，使原代肝细胞无需依赖外部基质，形成150-175µm的球状团聚体。该模型的一大优势在于仅需1330-2000个细胞。最新研究指出，原代肝细胞的球状体培养可以持续5周，其CYP酶活性在整个培养期间保持稳定。

肝类器官模型则基于干细胞及其衍生物的3D结构重构，并能够有效再现肝脏微环境。肝类器官在传递细胞信号和细胞间相互作用方面表现出色，适合用于构建遗传性及感染性肝病模型。

四、共培养模型的应用

原代肝细胞的2D共培养模型将不同细胞类型混合以维持细胞功能，且可持续长达3周。该模型有助于研究肝细胞在药物性肝损伤中的反应。例如，原代肝细胞与成纤维细胞共同培养，以评估慢代谢化合物。

在3D共培养模型中，通过自组装球体及多种构建材料，原代肝细胞与其他肝细胞共同作用，实现细胞间信号传递。此技术可用于构建肝纤维化及药物性肝损伤模型，进一步评估药物交互作用和代谢特性。

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